Застосування RT-PCR в режимі реального часу в Covid-19

Що таке RT-PCR в реальному часі?

Додавання флуоресцентних генів до реакційної системи ПЛР, використовуючи накопичення флуоресцентного сигналу для моніторингу всього процесу ПЛР у режимі реального часу, а потім кількісне визначення невідомого шаблону за допомогою стандартної кривої називається флуоресцентною кількісною технологією ПЛР у реальному часі, також відомою як Q у режимі реального часу. -PCR.

Принцип ампліфікації ПЛР такий самий, як і у звичайного приладу ПЛР, за винятком того, що праймери, додані під час ампліфікації ПЛР, маркуються ізотопами, флуоресцеїном та ін. одночасно.

Ампліфіковані результати збираються та передаються в комп'ютерну систему аналізу та обробки через сигнал збору в реальному часі системи збору сигналів флуоресценції для отримання кількісного результату в реальному часі.

RT-ПЛР в реальному часі - один з найбільш широко використовуваних лабораторних методів виявлення вірусу COVID-19. Хоча багато країн використовували RT-PCR в реальному часі для діагностики інших захворювань, таких як вірус Ебола та вірус Зіка, багатьом потрібна підтримка у адаптації цього методу до вірусу COVID-19, а також у збільшенні національних можливостей тестування.

Як працює RT-PCR в реальному часі з вірусом COVID-19?

Зразок відбирають з частин тіла, де збирається вірус COVID-19, таких як ніс або горло людини. Зразок обробляють декількома хімічними розчинами, які видаляють такі речовини, як білки та жири, і виділяють лише РНК, наявну у зразку. Ця витягнута РНК являє собою суміш власного генетичного матеріалу людини і, якщо є, РНК вірусу.

РНК зворотно транскрибується в ДНК за допомогою специфічного ферменту. Потім вчені додають додаткові короткі фрагменти ДНК, які доповнюють конкретні частини транскрибованої вірусної ДНК. Якщо вірус присутній у зразку, ці фрагменти прикріплюються до цільових ділянок вірусної ДНК. Деякі додані генетичні фрагменти використовуються для побудови ланцюгів ДНК під час ампліфікації, а інші використовуються для побудови ДНК та додавання міток маркерів до ниток, які потім використовуються для виявлення вірусу.

Потім суміш поміщають в RT-PCR-апарат. Машина циркулює через температури, які нагрівають і охолоджують суміш, щоб викликати конкретні хімічні реакції, що створюють нові, однакові копії цільових ділянок вірусної ДНК. Цикл повторюється знову і знову для продовження копіювання цільових ділянок вірусної ДНК. Кожен цикл подвоює попереднє число: дві копії стають чотирма, чотири екземпляри стають восьмима тощо. Стандартний режим RT-PCR в реальному часі зазвичай проходить через 35 циклів, а це означає, що до кінця процесу з кожної ланцюга вірусу, що присутній у зразку, створюється близько 35 мільярдів нових копій зрізів вірусної ДНК. .

По мірі створення нових копій вірусних секцій ДНК маркерні мітки прикріплюються до ланцюгів ДНК, а потім випускають флуоресцентний барвник, який вимірюється комп'ютером машини і подається в режимі реального часу на екрані. Комп'ютер відстежує кількість флуоресценції у зразку після кожного циклу. Коли певний рівень флуоресценції перевищується, це підтверджує наявність вірусу. Вчені також стежать за тим, скільки циклів потрібно, щоб досягти цього рівня, щоб оцінити ступінь тяжкості інфекції: чим менше циклів, тим сильніше вірусна інфекція.

Навіщо використовувати RT-PCR в режимі реального часу?

Техніка RT-PCR в реальному часі є дуже чутливою і специфічною і може поставити надійний діагноз лише за три години, хоча лабораторії займають в середньому від шести до восьми годин. Порівняно з іншими доступними методами виділення вірусів, RT-PCR в реальному часі значно швидший і має менший потенціал зараження або помилок, оскільки весь процес може здійснюватися в закритій трубці. Він продовжує залишатися найбільш точним методом виявлення вірусу COVID-19.

Однак RT-PCR в реальному часі не може бути використаний для виявлення минулих інфекцій, що важливо для розуміння розвитку та поширення вірусу, оскільки віруси присутні лише в організмі протягом певного періоду часу. Інші методи необхідні для виявлення, відстеження та вивчення минулих інфекцій, особливо тих, які можуть розвинутися та поширитися без симптомів.